Synapsen sind interzelluläre Verbindungen zwischen Neuronen im Nervensystem. Sie bestehen aus der präsynaptischen Endigung, dem synaptischen Spalt und der postsynaptischen Region. Information, die in Form eines Aktionspotentials an der Präsynapse ankommt, wird mittels chemischer Neurotransmitter, die in synaptischen Vesikeln (SV) des präsynaptischen Cytoplasmas aufbewahrt werden, zum postsynaptischen Neuron übertragen.

SVs sind kleine Speicherorganellen, die sich im präsynaptischen Cytoplasma eines jeden Neurons befinden. Sie enthalten Neurotransmitter wie zum Beispiel Glutamat oder ɣ-Aminobuttersäure und durchlaufen einen Transport-Zyklus in der Präsynapse. Der SV Kreislauf beinhaltet den Import von Neurotransmittern in die Vesikel, ’Docking‘, ‚Priming‘ und Fusion mit der präsynaptischen Membran zur Freisetzung des Neurotransmitters und die Endozytose einschließlich der Wiederverwertung der Vesikel.

Während die Proteine, die den SV Kreislauf steuern, in den letzten Jahrzehnten identifiziert wurden, wissen wir immer noch sehr wenig über die Protein-Interaktionen, welche die einzelnen Schritte des Kreislaufs steuern. Wie es auch von anderen Transportmechanismen bekannt ist, wird der SV Kreislauf durch nicht-kovalente Protein-Protein- und Protein-Lipid-Interaktionen, die sich bei Bedarf ausbilden und dissoziieren, gesteuert. Die entstehenden supramolekularen Komplexe beinhalten lösliche Proteine und Membrankomponenten in bislang nicht bekannten Stöchiometrien. Insbesondere die Membranfusion basiert nicht nur auf Interaktion zwischen Membranproteinen, sondern auch auf der Bildung von Mikrodomänen, bei denen Proteine und Lipide Cluster bilden, deren Zusammensetzung weitgehend unklar ist. Die Unfähigkeit, diese Membranprotein-Verbände zu definieren und ihre Eigenschaften zu studieren, ist ein Hauptproblem für das vollständige Verständnis des molekularen Prozesses der Exozytose und des Recyclings.

Bisher basiert das Wissen über Proteinkomplexe, die an der synaptischen Membran wirken, auf Studien mit isolierten Proteinen (gewöhnlich handelt es sich hierbei um binäre und tertiäre Interaktionen) und auf Pulldowns oder Immunopräzipitationen unter Verwendung von Detergenzien, welche die native Membranumgebung beeinflussen. Wir entwickeln neue massenspektrometrische Methoden, die auf diese Fragestellungen ausgerichtet sind. Die Analyse isolierter SVs wird als Startpunkt für weitere Analysen von Proteinkomplexen auf der präsynaptischen Seite dienen. Dies beinhaltet zum Beispiel die immer noch rätselhafte Architektur membrangebundener Vesikel. Bis heute ist nicht bekannt, wo genau sie an die präsynaptische Membran binden, welche Proteine interagieren und welche Proteinstöchiometrien in diesen Komplexen vorliegen.

Medizinische Relevanz für neurodegenerative Krankheiten
SVs sind insofern besonders, dass sie während eines jeden exo- / endozytotischen Kreislaufs sorgfältig regeneriert werden müssen. Dies bedingt, dass Kontrollmechanismen vorhanden sind, die die vollständige und korrekte Assemblierung gewährleisten, was durch lockere, aber spezifische „Supercluster“ vermittelt werden könnte. Die Erforschung dieser Cluster und ihrer Interaktionen in der Synapse ist außerordentlich wichtig, um den Mechanismus der Signalübermittlung in Neuronen zu verstehen. Nur dieses Wissen kann den Weg zur Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen neurodegenerative Unregelmäßigkeiten und Krankheiten ebnen. Wir hoffen, durch unsere Forschung die wichtigen Protein-Protein- und Protein-Lipid-Interaktionen in neuronalen Synapsen aufzuklären und so unser Wissen über den Mechanismus der Signalübertragung in Nervenzellen zu erweitern, damit Funktionsmodelle entwickelt und therapeutische Ziele für die klinische Forschung zur Verfügung gestellt werden können.
Die Relevanz der identifizierten Protein-Protein-Interaktionen für neurodegenerative Krankheiten soll somit untersucht werden. Dafür werden synaptische Vesikel und Synapsen aus gesundem und krankem Gewebe isoliert und die identifizierten Protein-Protein- und Protein-Lipid-Interaktionen verglichen und bewertet. Ein wichtiger Aspekt ist auch die Untersuchung von Proteinen, die Neurodegeneration hervorrufen wie zum Beispiel α-Synuclein. Eine Fehlfaltung dieses Proteins und daraus folgende Aggregation spielt häufig eine wichtige Rolle bei neurodegenerativen Krankheiten. Die Strukturen in fehlgefalteten und aggregiertem Zustand werden im Detail untersucht, um mit diesen neuen Erkenntnissen zum Verständnis der Interaktionen in der degenerierten Synapse beizutragen.

Strukturelle Massenspektrometrie
Wir kombinieren verschiedene Quervernetzungsstrategien mit der Proteomik, der Lipidomik und der nativen Massenspektrometrie von intakten Proteinkomplexen, um Protein-Lipid-Komplexe in SVs und der neuronalen Synapsen zu studieren. Während die Proteomik und Lipidomik die Komponenten der Protein-Lipid-Komplexe identifizieren, liefert die strukturelle Massenspektrometrie neue Einblicke in die Protein-Lipid-Interaktionen. Die native Massenspektrometrie beinhaltet die Analyse intakter Proteine und Protein-Komplexe in der Gasphase eines Massenspektrometers und zeigt deren Zusammensetzung, Stöchiometrie, Topologie, Heterogenität, Interaktionen der Untereinheiten sowie die Ligandenbindung der Komponenten. Die native Massenspektrometrie erlaubt die Analyse über einen weiten Bereich des Masse-zu-Ladung-Verhältnisses und ermöglicht somit die Analyse von kleinen Proteinuntereinheiten bis hin zu großen Proteinkomplexen in derselben Messung. Dies ist besonders vorteilhaft für heterogene Proteinkomplexe, welche in den SVs zu finden sind. Die native Massenspektrometrie wird durch verschiedene (chemische) Quervernetzungsstrategien ergänzt, um Einblicke in die direkten Kontaktstellen innerhalb der Proteinkomplexe zu erhalten.

Q Exactive Plus hybrid quadrupole-orbitrap Massenspektrometer

Wir benutzen das Q Exactive Plus sowohl für die Identifizierung von Proteinen und Lipiden als auch für weiterführende Untersuchungen, wie zum Beispiel Crosslinking oder PTM Analyse. Das Q Exactive Plus ist mit einem Dionex Ultimate LC System gekoppelt, es kann aber auch mit direkter Einspritzung betrieben werden.

Q-ToF Ultima

Modifiziert für die Transmission von hochmolekularen Komplexen.
Wir verwenden das Q-ToF Ultima für die Analyse von intakten Protein-Liganden –Komplexen, um die Stöchiometrie und die Interaktion der Proteinmodule zu bestimmen. Wir können zusätzlich Informationen zur Ligandenbindung und zur Stabilität der Proteinkomplexe erhalten.

Q-ToF Synapt G1

modifiziert für die die Transmission von hochmolekularen Komplexen. Durch die eingebaute Ionenmobilitätszelle haben wir weitere Möglichkeiten, um z.B. die Konformation und Stabilität von Protein-Ligand-Komplexen zu untersuchen.

LTQ Orbitrap XL Hybrid Ionenfallen-Massenspektrometer

Die LTQ Orbitrap XL wird in unserem Labor primär für Lipidomanalysen genutzt. Sie ermöglicht die MSn-basierte Identifizierung von Lipiden und ist mit zwei Fragmentierungstechniken ausgestattet. Die direkte Kopplung an ein Waters nanoAcquity UPLC System wird für die Charakterisierung komplexer Lipidome genutzt.

*zu gleichen Teilen beteiligt, #co-korrespondierender Autor

Frick M, Schwieger C, Schmidt C (2021)
Liposomes as carriers of membrane-associated proteins and peptides for mass spectrometric analysis.
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doi: 10.1002/anie.202101242

Wittig S, Ganzella M, Barth M, Kostmann S, Riedel D, Pérez-Lara Á, Jahn R & Schmidt C (2021)
Cross-linking mass spectrometry uncovers protein interactions and functional assemblies in synaptic vesicle membranes. Nat Commun 12, 858
doi: 10.1038/s41467-021-21102-w

Melissa Frick, Carla Schmidt (2019)
Mass spectrometry-A versatile tool for characterising the lipid environment of membrane protein assemblies.
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Blees A, Januliene D, Hofmann T, Koller N, Schmidt C, Trowitzsch S, Moeller A, Tampé R (2017)
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Instrument response of phosphatidylglycerol lipids with varying fatty acyl chain length in nano-ESI shotgun experiments. Chem Phys Lipids.
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Mazhab-Jafari MT, Rohou A, Schmidt C, Bueler SA, Benlekbir S, Robinson CV, Rubinstein JL (2016)
Atomic model for the membrane-embedded VO motor of a eukaryotic V-ATPase. Nature 539(7627):118-122
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Liko I, Degiacomi MT, Mohammed S, Yoshikawa S, Schmidt C#, Robinson CV# (2016)
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http://www.biochemtech.uni-halle.de/815_3020829/

http://www.uni-halle.de

http://proteinzentrum.uni-halle.de/?lang=de

https://rtg2467.uni-halle.de/